去年，關于120萬一針的CAR-T天價療法的新聞傳遍大江南北。而付出如此昂貴的代價，白血病又是否得以真正治愈呢？近日，新浪、騰訊、搜狐等多家媒體紛紛報道，美國CAR-T之父Carl June教授在著名期刊《Nature》發表最新論文，詳細介紹了世界第一位接受 CAR-T治療的患者 Bill Ludwig和第二位接受CAR-T治療的 Doug Olson的治療結果。在接受治療超過十年之后，兩人體內均一直未再檢測到白血病跡象， Carl June教授表示，現在可以認為CAR-T確實可以真正治愈白血病。
圖a. 媒體新聞報道[1]
在這項研究中，Carl June實驗室應用了Fluidigm CyTOF質譜流式技術，對CAR-T細胞的表型和功能進行了深入且長期的追蹤研究，以下，我們就為您就這項研究成果做詳細介紹。”
[1] 新聞引自：
《搜狐網》https://www.sohu.com/a/520537897_121124565
《騰訊網》https://new.qq.com/rain/a/20220203A0245700
《新浪財經》https://cj.sina.com.cn/articles/view/5044281310/12ca99fde02001r4be
CAR-T療法，即嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是將患者的T淋巴細胞（具有天然抗感染和抗癌作用）分離出來，通過基因重新編輯讓T淋巴細胞帶上能夠識別腫瘤細胞抗原的受體，并進行大規模的體外擴增CAR-T細胞，再回輸到患者體內，CAR-T細胞便會特異性地攻擊腫瘤細胞，從而快速、精準地治療腫瘤。CAR-T療法在多種癌癥中顯示了治療潛力。然而，對輸入體內的CAR-T細胞的長期潛力和克隆穩定性知之甚少。
2022 年2月2日，賓夕法尼亞大學&費城兒童醫院的研究人員在 Nature雜志在線發表了題為Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4 CAR T cells的文章【1】，并受到了廣泛的關注。作者利用Fluidigm質譜流式技術（CyTOF）和CITE-seq等多組學技術深入分析了CAR-T治療不同階段患者體內的CAR-T細胞特性和變化，首次揭示了長期持久CAR-T細胞的特征。
作者利用質譜流式，設計了由40個markers組成的panel，其中35個marker（表面和胞內）用于識別T細胞, 另外5個marker用于去除非T細胞。對兩位十年前首批接受CAR-T治療后獲得完全緩解的慢性淋巴細胞白血病患者進行跟蹤檢測。
患者1中，CAR-T輸入后1.8個月，CD8 CAR-T細胞占比29.3%，在隨后的時間點出現比例下降；CAR-T細胞輸入后1.4年，CD4 CAR-T細胞占比97.5%；CAR-T細胞輸入后3.4年到9.3年；CD4 CAR-T細胞占比99.6%(圖1a-c)。患者2中，以更加延遲的CAR T細胞擴增為特征，并表現整體相似的趨勢。CD8 CAR-T在初始時間點為主要的亞群，隨后逐漸減少，CAR-T細胞輸入后7.2年，CD4 CAR-T細胞占比97.6%。同時發現CD4-CD8-CAR-T細胞亞群在患者2中很明顯，CAR-T細胞輸入后2.5個月和1.6年，分別占總CAR-T細胞的33.4%和46.5%；CAR-T細胞輸入后2.8年、4.7年和7.2年，分別減少到12.9%、8.2%和0.5%(圖1b, c)。該細胞亞群有著獨特的細胞表型，表達細胞毒性標記物GZMB, 2B4，CD57, CD85j，T-bet和PD-1，以及Helios（Helios--T細胞活化和增殖的一種標志物-編者注【2】）。這些特征明顯地將該亞群與其他類似的細胞毒性CD8 T細胞區分開(圖1b)。基于這種獨特的標記，作者將其標記為CD4-CD8- Helioshi CAR-T細胞。該亞群在患者1輸入CAR-T細胞1.8月的樣本中比率較低(3.2%)，并在CAR-T細胞輸入后1.4年變得更少(小于1%)(圖1c)。
圖1.質譜流式多個時間點分析CD3 CAR-T細胞。a. UMP降維分析患者不同時間點的CD3 CAR-T細胞，顏色代表采樣時間點；b. 選定細胞標記物的蛋白表達； c. UMAP降維展示5個主要的CAR - T細胞群組成，顏色代表細胞亞群；d. 統計分析不同細胞中Ki67的表達；e. CAR - T細胞亞群中各標記物表達的熱圖。
CD4 CAR-T細胞高表達Ki67，為增殖表型(圖1b)。在兩例患者中，Ki67hiCD4 CAR-T細胞穩步出現。患者1中，CAR-T細胞輸入后1.8個月時占總CAR-T細胞的15.9%；CAR-T輸入后9.3年增加到97.0%。患者2中，Ki67hi CD4 CAR-T細胞在CAR-T細胞輸入后2.4個月時占0.2%， CAR-T細胞輸入后7.2年增加到87.2%(圖1b, c)。比較CAR CD4 T細胞和CAR- CD4 T細胞，發現Ki67的表達具有很強的CAR T細胞特異性(圖1d)。CD8 CAR-T細胞整體上也表現出增殖趨勢，但是Ki67的表達普遍較CD4 CAR-T細胞低且不穩定(圖1d)。且Ki67hi CD4 T細胞表達了不同的標志物，包括激活標志物CD38、HLA-DR和CD95、轉錄因子EOMES和TOX、檢查點標志物CTLA-4, LAG-3和TIGIT，以及記憶型標志物CD27和CCR7(圖1e)。
綜上結果表明兩名患者體內的CAR-T細胞治療經歷了兩個不同的階段，初始階段以CD8 CAR-T和CD4-CD8- CAR-T細胞為主，負責殺傷腫瘤細胞，而長期緩解階段則以CD4 CAR-T細胞為主，負責控制腫瘤細胞，且CD4 CAR-T細胞表現出持續增殖和殺傷腫瘤細胞的特性，是持久臨床反應的關鍵特征。想要長久控制腫瘤，也需要多種不同CAR-T細胞類型的組合。此項研究為與抗癌反應和長期緩解相關的CAR-T細胞特征提供了新的見解，且為CAR-T細胞療法的長期治療效果和整合到體內的安全性提供了概念證明。Carl June表示，現在可以認為CAR-T確實可以真正治愈白血病。
這項研究成功地運用了CyTOF技術，對患者體內CAR-T細胞表型和功能進行深入而細致的分析。Fluidigm公司獨有的質譜流式技術是一種高通量單細胞蛋白質分析技術，利用金屬元素作為抗體的標簽，以質譜作為檢測手段，可同時分析單細胞表面和內部的50多種標志物，由于采用特殊的金屬元素作為檢測信號，背景信號極低，徹底解決傳統流式的熒光串色的問題，并在多領域得到廣泛應用。
參考文獻：
1 Melenhorst J. J.,Chen G. M., Wang M. et al. "Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4 CAR T cells." Nature. 2022 Feb 2. doi: 10.1038/s41586-021-04390-6.
2 Tatiana Akimova, Ulf H Beier, Liqing Wang, et al. "Helios expression is a marker of T cell activation and proliferation" PLoS One2011;6(8):e24226. doi: 10.1371/journal.pone.0024226. Epub2011 Aug 30.
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